美国基因与细胞治疗学会(ASGCT) 是一家专业的非营利性医疗和科学组织，致力于了解、开发和应用基因、相关细胞和核酸疗法，以及促进基因治疗的专业和公众教育。ASGCT在美国和世界各地拥有4,800多名会员，是目前参与基因和细胞治疗研究的个人最大的协会。总部位于密尔沃基。

2024年5月7日至11日美国巴尔的摩，ASGCT成功举办第27届年会。

22024年美国基因与细胞治疗学会{ASGCT}年会展报FSHD部分摘要如下：

258：验证EPI-321对FSHD的安全性：用于表观遗传基因治疗的综合脱靶表征平台

所属公司：1Epic Bio公司,2 Excelra/BISC Global"

人员：Linsin A. Smith1, Tyler Borrman1, Melanie R. Silvis1, Emily Dabe2, Kaitlin Pensabene1, Siddaraju V. Boregowda1, Abhinav Adhikari1, Christopher Still1, Tengyu Ko1, Timothy Daley1, Robin W. Yeo1, Alexandra Collin de L'Hortet1, Yanxia Liu1

摘要：

基因组和表观基因组编辑在精确改变DNA和调节基因表达方面具有巨大潜力，可用于治疗以前无法治疗的疾病。然而，实现这一潜力仍然存在重大障碍，包括开发高精度基因组和表观基因组编辑工具。一个众所周知的障碍是基于CRISPR 的编辑器存在脱靶效应的风险，其中意外结合到基因组的非靶区域可能会导致不良且潜在危险的结果。

Epic公司正在推进表观遗传编辑领域的发展，以控制基因表达并治疗基因组编辑无法达到的疾病。面肩肱型肌营养不良症 (FSHD) 就是一个典型的例子，该病影响着全球80万人，且目前无治疗方法。FSHD与4号染色体上D4Z4卫星区域的低甲基化有关，这会导致DUX4的不适当表达和骨骼肌中进行性肌肉萎缩。利用我们专有的GEMS平台，Epic开发了EPI-32疗法，这是一种针对FSHD的表观遗传疗法，靶向D4Z4区域，通过将DNA甲基化恢复到健康水平来永久抑制 DUX4表达。

为了验证EPI-321的安全性，我们进行了全基因组脱靶表征，发现EPI-321没有介导直接的脱靶效应。与采用双链断裂进行脱靶分析的基因组编辑技术不同，表观基因组编辑技术需要基于预期的表观遗传修饰机制进行更全面的表征。在这里，我们展示了用于脱靶评估的全方位平台，并展示了其在EPI-321脱靶表征中的应用。我们的综合平台集成了计算机脱靶预测、全基因组表达谱、全基因组亚硫酸氢盐测序以及跨各种模型系统的靶向验证测定，以便可靠地识别假定的脱靶效应。将脱靶表征平台应用于EPI-321后发现，EPI-321治疗没有导致直接脱靶事件，凸显了我们的GEMS技术的安全性和精确性。

关于美国Epic公司可查看往期介绍：最新资讯 | FDA授予EPI-321孤儿药资格认定，EPI-321是美国Epic公司治疗面肩肱型肌营养不良症的新型候选基因药物

495：通过高通量AAV衣壳和货物工程开发面肩肱型肌营养不良症 (FSHD) 的强效基因治疗候选药物

所属公司：美国Kate公司

人员：Saurav Seshadri, Kyle Brown, Shayan Tabebordbar, Edward Marsh, Jana Jenquin, Janelle Stricker, Brian Ferguson, Mark Fielden, Sharif Tabebordbar

摘要：

面肩肱型肌营养不良症 (FSHD) 是一种常染色体显性遗传性疾病，估计每 8,000人中就有1人受到影响。FSHD患者通常表现出面部、肩部、上臂、腿部和腹部肌肉进行性无力；大约20%的患者最终需要使用轮椅，大多数患者会感到疼痛和疲劳，常常使人衰弱。转录因子DUX4的去抑制已被确定为FSHD的发病机制。患者肌肉中DUX4基因的表观遗传沉默不充分会导致DUX4的异常表达，这对成熟的肌纤维有毒性。因此，DUX4转录物的敲除已被推进作为FSHD的治疗策略，并在临床前模型中显示出疗效。在这里，我们证明了新型MyoAAV介导的RNAi疗法对FSHD的功效，无论是在体外（在人类患者来源的肌管中）还是在体内（在ACTA1-MCM中；FLExDUX4小鼠模型，一种可诱导表达DUX4的双转基因系） 在骨骼肌中，它再现了FSHD疾病相关的生化、组织学和功能表型）。首先，我们使用稳定表达标记突变DUX4转基因的工程HEK293细胞系进行平铺筛选，以确定最有效的DUX4靶向人工miRNA序列。该筛选的结果在FSHD患者来源的肌管中得到了验证。这些细胞在4q染色体的D4Z4区域含有引起疾病的收缩，负责DUX4的表观遗传沉默，并且在分化时表现出DUX4及其转录调节靶基因的表达。根据DUX4的程度和这些细胞中实现的靶基因敲低对候选 miRNA序列进行排序，并将选定的序列进行其他表征。我们在人类肌管中进行了RNA测序，以评估含有miRNA的转录物的处理效率。为了确保我们的候选 miRNA序列对DUX4具有特异性，并且不会导致意外转录物的敲低，我们在人类原代肌管中应用了使用RNAseq的无偏倚、经验方法。我们根据最佳效力和加工以及最小的脱靶效应选择了我们的主要miRNA候选者。在单独的实验中，我们在非人类灵长类动物中进化出了肝脏去靶向、肌肉趋向性的MyoAAV衣壳变体。我们将先导miRNA序列包装在肝脏脱靶、肌肉趋向性MyoAAV中，并在体外和体内测试了所得的候选序列。我们证实，在人肌管中，在相关剂量下，DUX4和靶基因可被有效敲除、高效加工以及最小的脱靶效应。为了评估体内功效，我们使用了ACTA1-MCM和FLExDUX4小鼠。我们给这些小鼠注射我们的候选药物或媒介物，并通过注射他莫昔芬诱导所有小鼠中的DUX4表达。使用提供DUX4 miRNA的MyoAAV治疗可保护小鼠在跑步机上至力竭的时间免受严重损害，防止组织病理学标记物的表达，并阻止DUX4和靶基因的升高，所有这些都在载体治疗的小鼠中观察到。总而言之，这些数据支持我们治疗FSHD的基因疗法候选药物的进一步开发和潜力。

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699：通过精确的表观基因组编辑彻底改变安全的基因和细胞治疗

所属公司：Epic Bio公司

人员：Stanley Qi

摘要：

表观基因组的精确控制是推进基因和细胞治疗超出基因编辑范围的疾病的关键。虽然我们目睹了通过基因编辑实现基因治疗的生物技术进步的快速革命，但由于疾病适应症范围有限和潜在的永久性编辑副作用，仍然存在重大挑战。为了应对这些关键挑战，我们专注于发现新技术，使人类表观遗传学的精确工程超越基因编辑。这项努力的动机首先是希望利用最好的工具来应对人类最需要的疾病，并希望以最安全、最有效的方式做到这一点。为了应对该领域的挑战，我们开发了高度紧凑的dCas系统（dCasMINI，Cas9的1/3大小），以及高度紧凑且有效的表观遗传调节剂（小于200 bp）。我们已经证明了它们在基因转录和表观遗传修饰的多功能控制以及精确靶向活细胞和体内大大扩展的基因组背景方面的实用性。该平台本质上是安全的，因为它旨在实现基因表达的改变，而不损坏或突变基因组DNA。最近的研究表明Cas9核酸酶或碱基编辑器可以诱导染色体易位和基因毒性。与基于基因编辑的方法相比，我们证明表观遗传编辑是安全的，不会对细胞产生永久性脱靶或毒性。此外，我们开发的dCasMINI分子具有极低的免疫原性，优于细菌来源的更大且更具免疫原性的Cas9或Cas12蛋白。

尽管表观遗传编辑具有巨大的潜力，但我们已经解决了将表观遗传编辑应用于临床应用的两个关键挑战：首先，我们生成了一个紧凑的基于CRISPR的表观遗传平台（有效负载大小减少了2/3以上），能够通过体内单个腺相关病毒（AAV）或脂质纳米颗粒（LNP）；其次，我们通过机器学习算法和大规模筛选建立了一个全面的表观遗传调节剂库，这使我们能够以可编程的方式激活和抑制多个基因表达。我们基于这两项重大进展开发了一个集成平台，称为基因表达调节系统（GEMS），它充分发挥表观遗传编辑的潜力，精确调节基因表达。

我们展示了GEMS持久表观遗传编辑平台在治疗遗传性疾病方面的临床应用，包括面肩肱型肌营养不良症 (FSHD)，这些疾病超出了传统基因编辑的范围。我们的FSHD项目将于今年进入临床，这可能是表观遗传编辑技术的首个项目。为了进一步证明其实用性，我们可以将表观遗传编辑器应用于人类T细胞，以增强T 细胞功能，从而更好地消除肿瘤恶性肿瘤。值得注意的是，我们已经鉴定出能够持久且持续激活靶基因的表观遗传调节剂，为解决各种单倍体不足疾病的新治疗应用开辟了可能性。总之，精确的表观遗传编辑技术为开发下一代基因疗法带来了巨大的希望。

总结：我们描述了通过控制基因编辑之外的表观基因组来实现基因治疗的重大进步。传统的基因编辑，如CRISPR-Cas9，已经具有革命性，但也存在局限性，例如DNA的永久性改变和疾病范围有限。为了克服这些问题，我们开发了表观遗传编辑新技术，以在不改变DNA序列的情况下控制基因的表达方式。一项关键的发展是创建更小的工具（dCasMINI）。这些工具更安全，不会引起不必要的免疫反应。我们使用机器学习等先进技术构建了一个可以控制基因表达的工具库。我们重点介绍其在治疗当前基因编辑方法无法解决的疾病方面的临床应用。我们在治疗特定肌营养不良症 (FSHD) 和改善癌症治疗中的T细胞功能方面取得的成功代表着基因治疗向前迈出了重要一步，为治疗遗传性疾病提供了新的、更安全的、更通用的方法。

700：EPI-321：针对D4Z4表观基因组的FSHD新型表观遗传基因疗法

所属公司：Epic公司

人员：Alexandra Collin de L'Hortet, Abhinav Adhikari, Siddaraju Boregowda, Hao Zheng, Vishi Agarwal, Andrew Norton, Nalinda Wasala

摘要：

面肩肱型肌营养不良症 (FSHD) 是成人肌营养不良症最常见的类型之一，年发病率约为万分之一，影响全球约100 万人。由于无法治愈，目前的治疗策略仅涉及控制症状以改善整体生活质量。肌肉中致病蛋白DUX4的错误表达通过激活细胞凋亡和其他下游途径导致缓慢且进行性的肌肉退化。DUX4基因编码于 D4Z4大卫星阵列的4q35染色体远端区域。在FSHD患者中，D4Z4 阵列低甲基化，导致随机和短暂的DUX4表达，这使得治疗的开发具有挑战性。在Epic-Bio，我们利用专有的基因表达调制系统 (GEMS) 平台开发一种针对FSHD的治疗方法，该方法针对D4Z4表观基因组并永久抑制DUX4表达。我们的产品EPI-321是一种单载体AAV血清型rh74，编码与基因抑制调节剂融合的超紧凑、催化失活的Cas蛋白（效应器），在肌肉特异性启动子CK8e和靶向D4Z4基因座的引导RNA的表达下。我们的临床前研究表明，在体外，无论D4Z4重复次数多少，EPI-321给药都会对10种不同FSHD患者来源的永生化和原代成肌细胞中的 DUX4和DUX4下游基因表达产生强烈且剂量依赖性的抑制，并显示出抗凋亡作用通过Caspase 3/7染色测量活性。从机制上讲，EPI-321显示D4Z4靶基因座的重新甲基化导致DUX4表达抑制。此外，在人源化FSHD小鼠模型中对 EPI-321的体内评估显示，DUX4通路在mRNA和蛋白质水平上具有剂量依赖性抑制，并且在肌肉组织中具有抗凋亡活性。此外，使用由EPI-321转导的FSHD 患者来源的永生化成肌细胞进行3D工程人体肌肉组织 (3D EMT)，可有效抑制 DUX4通路基因长达46天，并表现出肌肉收缩力的显著剂量依赖性改善。总而言之，我们的研究结果为EPI-321作为一种潜在的单次给药基因疗法通过表观遗传沉默永久抑制致病性DUX4 基因来治疗FSHD提供了强有力的证据。我们打算今年提交研究性新药 (IND) 申请，并期待在 2024 年开始首次人体试验。

总结：面肩肱型肌营养不良症 (FSHD) 是一种进行性肌肉退行性疾病，影响全球约100 万人，且无法治愈。Epic公司正在开发 EPI-321，这是一种潜在的一次性治疗方法，通过在表观遗传水平上解决DUX4基因来针对FSHD的根本原因。与其他基于CRISPR的疗法不同，EPI-321不会改变DNA序列本身。EPI-321永久关闭在FSHD中失调的DUX4基因{DUX4的不适当表达，从而导致肌肉随着时间的推移而退化} 在我们Epic Bio的实验中，EPI-321显示出有希望的结果。在来自FSHD患者的肌肉细胞中，它有效降低了有害DUX4的活性。在患有FSHD的人源化小鼠中，EPI-321治疗成功到达其肌肉组织，并降低了DUX4基因的活性。除了降低DUX4基因的活性外，EPI-321在我们的研究中还显示出提高肌肉力量的积极作用。

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723：利用小分子寡核苷酸活性增强剂增强反义寡核苷酸功效

所属机构：1加拿大艾伯塔大学医学遗传学系，2俄勒冈州立大学生物医学科学系”

人员：Saeed Anwar 1、Scott David-Bittner 2、Annie Tang 1、Rika Maruyama 1、Hong M. Moulton 2、Toshifumi Yokota 1

摘要：反义寡核苷酸 (ASO) 是合成寡聚体，善于结合RNA并通过各种机制调节基因表达，包括RNase H介导的裂解、直接空间阻断、剪接调节、非编码RNA 抑制和基因激活等机制。这些寡聚体有望治疗一系列复杂的遗传疾病和罕见疾病。然而，它们在目标细胞和器官中（尤其是在体内）的活性不佳，这是一个重大挑战。全身给药后，ASO主要积聚在肝脏和肾脏中，而在其他组织中的积聚则明显减少。此外，ASO通常会被隔离在非生产性细胞内库中，例如内体区室，从而阻碍有效的基因表达调节。本研究探讨了小分子寡核苷酸活性增强剂 (OAE) 可以显著增强ASO功效和安全性的假设。我们通过重新利用已获FDA批准或已针对其他适应症进行广泛研究的分子，开发了一个OAE微型库。据推测，这些分子可帮助ASO逃离内体包封，并在联合给药时以无毒方式增强ASO活性。我们在三种不同的体外疾病模型中展示了OAE对ASO治疗潜力的影响。我们的研究结果包括，在dysferlin缺乏的肢带型肌营养不良症隐性2型 (LGMDR2) 患者来源的成肌细胞中，靶向DYSF基因外显子27的磷二酰胺吗啉寡聚体 (PMO) 的外显子跳跃效率显著(约3倍) 增加，将非框架转录本恢复为框架内转录本，并表明潜在的功能改善，这可以通过增强的肌管融合指数来证明。此外，我们观察到OAE显著提高了锁核酸 (LNA) 和 2′-O-甲氧基乙基核糖 (MOE) 缺口体在面肩肱型肌营养不良症 (FSHD) 患者来源的肌管中DUX4转录本敲低的效果 (71-97%)。同时， DUX4下游基因（包括ZSCAN4、TRIM43和MBD3L2 ）的表达也显著降低。此外，我们证明了OAE能够改善针对进行性骨化性纤维发育不良 (FOP) 患者来源的成纤维细胞中的ACVR1 R206H等位基因 (15-25%) 的等位基因选择性LNA和MOE缺口体ASO 。在这些基于细胞的疾病模型和ASO化学物质中，OAE联合给药可显著增强ASO活性。因此，OAE成为增强各种ASO化学物质活性的实用工具，有可能扩大基于ASO策略的治疗适用性。正在进行的研究重点是这些 OAE 在相关小鼠模型中的体内功效和安全性，目的是将这些发现转化为临床可行的治疗方法。总结：我们正在探索使用特殊分子（称为反义寡核苷酸 (ASO)）治疗遗传疾病的新方法。这些类似 DNA 的小分子旨在纠正特定细胞中的基因功能，但经常被困在不需要的身体部位或细胞内，从而降低其有效性。我们的解决方案是一种新技术，即寡核苷酸活性增强剂 (OAE)，它改变自临床上已经使用的化合物。OAE可帮助ASO到达身体的正确区域并有效避免细胞陷阱。在三种遗传疾病（肢带型肌营养不良症2型 (LGMDR2)、面肩肱型肌营养不良症 (FSHD) 和进行性骨化性纤维发育不良 (FOP)）的实验室模型上进行了测试，我们的方法显示出巨大的前景。我们使用了三种不同类型的ASO来针对每种疾病进行定制，OAE显著提高了它们的性能。这项研究表明OAE可以增强遗传疾病的ASO治疗。我们现在正在转向动物研究，这是迈向人类治疗的重要一步。

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1706：通过AAV介导CRISPR-Cas13疗法治疗FSHD可能需要克服体型和免疫方面的挑战

所属机构：1美国俄亥俄州哥伦布市全国儿童医院阿比盖尔·韦克斯纳研究所基因治疗中心，2美国俄亥俄州立大学医学院儿科系，3美国加利福尼亚州欧文市加州大学欧文分校”

人员：Manal Ali 1、Afrooz Rashnonejad 1,2、Kate Neal 1、Gerald Coulis 3、Armando Villalta 3、Scott Q Harper 1,2

摘要：

面肩肱型肌营养不良症 (FSHD) 是由肌肉中有毒DUX4基因的异常表达引起的，导致肌纤维死亡和功能障碍。目前尚无批准的疾病缓解治疗方法。我们假设 FSHD治疗应以DUX4抑制为中心，我们正在开发一种基于CRISPR-Cas13的方法来实现这一目标。Cas13已成为基于Cas9 的基因组编辑策略的有效替代方案，因为Cas13切割RNA而不是DNA，从而减少潜在的基因毒性。在这项研究中，我们使用了来自普雷沃菌属的Cas13b和Cas13d蛋白。分别为P5-125和黄色瘤胃球菌XPD3002细菌种类。Cas13b太大，无法在同一AAV基因组中共同包装引导 RNA (gRNA) 表达盒。第一代系统需要注射2个AAV，一个从U6启动子表达gRNA，第二个携带Cas13b蛋白表达盒。相比之下，Cas13d足够小，可以与gRNA表达盒共同包装在同一AAV中。尽管Cas13b和Cas13d功能相似，但它们来自不同的细菌物种并利用不同的gRNA结构。这就需要设计两套针对DUX4 mRNA的gRNA，然后我们进行体外和体内测试。我们从Cas13b开始。在FSHD细胞模型中使用各种结果测量鉴定先导gRNA后，我们使用两个FSHD小鼠模型在体内测试了该系统。在快速进展的基于AAV的FSHD小鼠模型中进行肌肉注射后，我们测量到AAV.Cas13b/gRNA1共同治疗的肌肉中DUX4 mRNA显著减少。这种敲低伴随着组织学的改善，以及早期时间点（2周）DUX4蛋白、DUX4激活生物标志物和凋亡细胞核的减少。在我们的FSHD基因小鼠模型 (TIC-DUX4) 中，Cas13b/gRNA1也能减少DUX4诱导的肌病，但保护作用会随着时间的推移而减弱。在野生型小鼠中，Cas13b表达的丧失伴随着骨骼肌中细胞毒性T细胞反应，表明对Cas13b蛋白的免疫反应。我们现在正在探索几种策略来克服这一免疫挑战，包括测试来自其他细菌物种的Cas13蛋白，例如Cas13d。对于较小的Cas13d酶，我们设计并测试了50种gRNA，与使用多种体外测定的非靶向对照相比，所有这些gRNA均导致DUX4显著降低。然后，我们根据其持续降DUX4反式激活活性和FSHD生物标志物表达以及在体外DUX4蛋白敲低80-90%的能力，选择了3个先导化合物。在我们的FSHD小鼠模型中，对单个AAV-Cas13d+gRNA的效力和耐久性的体内测试仍在进行中。我们得出的结论是，如果能够克服免疫反应的挑战，CRISPR Cas13是一种强大的体外DUX4 RNA靶向工具，也是一种有前途的体内DUX4 mRNA沉默策略。

总结：主要的FSHD基因DUX4通常在胎儿发育早期发挥作用，不应在人类肌肉中启动。然而，在FSHD患者的肌肉中，DUX4确实会开启，导致肌肉损伤并最终导致FSHD症状。不幸的是，目前尚无针对FSHD的有效治疗方法。我们的实验室多年来一直致力于开发新的治疗方法。在这里，我们正在开发一种针对FSHD的基因疗法，利用CRISPR技术来消除肌肉中的DUX4。这项名为CRISPR-Cas13的技术可以在不改变细胞DNA的情况下靶向任何基因的mRNA拷贝，使其比DNA（基因）编辑技术更安全。我们已经在FSHD临床前模型（细胞和小鼠）中开发并测试了多个Cas13系统，发现CRISPR-Cas13是DUX4的有效抑制剂，能够保护FSHD 小鼠免受肌营养不良症的影响。

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在许多疾病中，细胞和基因疗法往往结合起来作为基因工程细胞疗法，从而成为治疗获得性或遗传性疾病的极具前景的疗法。基因工程细胞疗法正以极快的速度发展以治疗基因遗传病，这些应用正处于从临床前到临床的不同发展阶段。

我们可以看到多个策略的基因疗法在临床前数据中有比较积极的数据，多家基因疗法研发公司布局FSHD药物管线，美国Epic公司、美国Armatus公司{Scott Harper博士}、加拿大Toshifumi Yokota博士{oligomics公司暂未正式对外公布}。其中美国Epic公司宣布在2024年下半年正式启动药物临床试验。

药物研发是需要一系列复杂的步骤，从靶点到临床再到最终上市，特别是基因疗法，存在诸多的困难和挑战，为了克服这些挑战，细胞和基因治疗公司需要采取创新的方法，寻找成本效益高的解决方案，并与政府、行业组织和其他利益相关者合作，共同推动行业的可持续发展。细胞与基因治疗市场正处于快速发展阶段，为患者提供了新的治疗选择，并为医疗行业带来了创新的解决方案。随着研究的深入和技术的进步，相信未来几年在基因治疗领域有更多的突破，值得我们持续关注和期待。